Żywo interesował się jednak nowinkami religijnymi, reformacją (przyjął kalwinizm), brał udział w sejmach, uczestniczył w dyskusjach i polemikach. Jednocześnie ujawnił się jego talent literacki. Przekonany o potrzebie rozwoju literatury narodowej i doskonaleniu narodowego języka, pisał wiele po polsku.
Porusza w nich problemy polityczne, społeczne, religijne i obyczajowe. Staje się szybko autorem głośnym i poczytnym, a król nagradza go wsią Temerowce, a w kilka lat później oddaje w dożywocie wieś Dziewięciolecie.
Rej pozostawił bogaty dorobek, pisał bowiem dużo i szybko, bez zbytniej pracowitości, stąd jego utwory często są mało wypracowane i niezbyt wypielęgnowane. Z pierwszych jego utworów przetrwała jedynie Krótka rozprawa między trzema osobami, Panem, Wójtem i Plebanem (1543), podpisana pseudonimem Ambroży Kurczbok Rożek.
W 1545 r. wydał Rej Żywot Józefa, utwór dramatyczny łączący ze sobą elementy misterium, moralitetu i komedii. Przedstawił całe życie Józefa, syna Jakuba i Rachel, sprzedanego przez zawistnych braci do Egiptu. Bohatera uwięzionego, a potem uwolnionego dzięki umiejętności wyjaśniania snów i podniesionego do godności wielkorządcy Egiptu.
Zobacz też : Mikołaj Rej - Żywot człowieka poczciwego i Krótka rozprawa...
Rok 1549 przynosi kolejny dramat Reja zatytułowany Kupiec. Jest opowieść o prostym, zwyczajnym człowieku, w którego losy wpleciony jest motyw Sądu Ostatecznego. Dzieło jest artystycznie nierówne, obok rozwlekłych wywodów o charakterze teologicznym są świetne sceny wzięte z realiów ówczesnego życia.
W 1557 r. ukazało się następne dzieło Reja: zbiór kazań przeznaczonych na niedziele i święta zatytułowane Postylla. Autor oburza się na świąteczne i kościelne ceremonie, na obrządki ludowe, zabobony i czary (np. na sobótkę świętojańską).
W 1558 r. ukazuje się bardzo ważne w twórczości Reja dzieło Wizerunek własny żywota człowieka poczciwego (przeróbka dzieła włoskiego). Treścią utworu jest wędrówka młodzieńca poszukującego właściwego modelu życia.
Odwiedza on różnych filozofów, aby dowiedzieć się, jak należy żyć. Autor kreśli przy tym obrazki obyczajowe i scenki zabarwione satyrycznie, krytykując wykroczenia przeciw dobrym obyczajom.
Następne dzieło Reja to Źwierzyniec (1562). Jest to zbiór ośmiowierszowy w czterech częściach. Pierwszą stanowią utwory poświęcone postaciom historycznym. W drugiej pojawiają się portrety przedstawicieli panującej dynastii, wojewodów, biskupów, kasztelanów.
Część trzecia poświęcona jest urzędom i instytucjom świeckim i duchownym. W czwartej części znajduje się kilka bajek zaczerpniętych prawdopodobnie ze zbioru Biernata z Lublina, lecz samodzielnie przerobionych. Następne wydanie Źwierzyńca zostało uzupełnione Figlikami - zbiorem żartobliwych, często nieprzyzwoitych anegdot.
Zobacz też : Humanizm
W 1568 r. Rej wydaje Źwierciadło składające się z kilku części, z których najobszerniejsza nosi tytuł Żywot człowieka poczciwego. Są to koleje życia polskiego szlachcica od kolebki do grobu opisane z dużym rozmachem i emocjonalnym zaangażowaniem.
We wszystkich utworach Rej dawał wyraz troski o losy ojczyzny. Jego zasługą jest również fakt, że pisał po polsku i stworzył podwaliny literatury polskiej.
To on jest autorem słynnego powiedzenia: „Niechaj to narodowie wżdy postronni znają, iż Polacy nie gęsi i swój język mają”.
